在生物医学研究领域，实验室培养的细胞通常根据其类型分为三类：贴壁细胞、悬浮细胞和半贴壁细胞。贴壁细胞会粘附在培养容器上，如组织培养塑料；悬浮细胞则随生长培养基自由悬浮，未粘附于容器；而半贴壁细胞则呈现出部分细胞附着、部分细胞悬浮的特征。

此外，细胞还可以按其生长特性分为有限增殖和无限增殖两类。有限增殖的细胞通常为原代细胞，或经过一定次数传代后停止生长的细胞系。而无限增殖的细胞具备持续分裂的能力，通常通过转化获得，表现出类似癌细胞的特征，如失去接触抑制和无限生长。在本文中，我们将重点介绍最常见的细胞类型：贴壁细胞和悬浮细胞。在进行细胞培养时，所有操作都应遵循无菌技术和适当的控制方法。

第一阶段：冷冻保存

在持续培养中，细胞会积累遗传不稳定性。因此，建议在收到细胞系后尽快进行冷冻保存，以保持细胞库的遗传特性接近源材料，并降低污染风险。冷冻时应在冷冻保护剂（如DMSO）的存在下，逐步降温（理想情况下每分钟1°C），以避免细胞内冰晶的形成，确保细胞的存活。

实验步骤：

1. 使用显微镜检查细胞的整体外观，确保没有微生物污染的迹象，并确认细胞处于对数生长期，细胞密度应维持在指导范围，活力大于90%。
2. 按照标准传代方法收集并计数细胞。悬浮细胞以每毫升2-5×10⁶个细胞的密度冷冻，贴壁细胞以每毫升1-2×10⁶个细胞的密度冷冻。
3. 依据细胞系特点选择合适的冷冻保护剂，并计算所需冷冻液的量按配方配置。
4. 以200×g离心细胞悬浮液5分钟，去除上清，并将细胞沉淀重新悬浮于PBS中。
5. 再次以200×g离心5分钟，去除上清液。
6. 将配置好的冷冻液重悬细胞沉淀，混匀后转移至冻存管，标记关键信息（如日期、名称、细胞编号等）。
7. 将冻存管放入冻存盒中，然后置于-80°C冷冻一夜，以控制温度下降。
8. 最终，将其转移至液氮罐中进行长期保存。

第二阶段：细胞复苏

在需要使用细胞时，尽快进行解冻以减少对细胞活力的负面影响。复苏时应通过离心去除冷冻保存剂。

实验步骤：

1. 从液氮中取出冷冻管，放入37°C水浴中轻轻摇动，监测解冻过程。当管内细胞解冻至黄豆大小时，取出冻存管。
2. 将冻存管内的细胞（1ml）转移到含有预热培养基（4ml）的15ml离心管中，进行200-250×g离心5分钟。
3. 去除上清液，并用适量预热培养基重悬细胞沉淀，接种至相应培养容器中，选择合适接种密度。
4. 根据细胞类型的需求，添加所需的生长因子等成分。

第三阶段：观察

应定期用显微镜和肉眼观察细胞的状态，检查是否有微生物污染，并评估细胞的健康状况，以决定是否需要进行传代培养。

实验步骤：

1. 用肉眼观察细胞培养状态，确保无污染。贴壁细胞培养基应为清澈，悬浮细胞则应有适度的浑浊度。
2. 在光学显微镜下检查：细胞粘附情况、细胞形态、融合度、细胞密度等，以监测细胞的健康与生长。

第四阶段：细胞维持和传代培养

当细胞健康生长并达到所需的汇合度时，可以进行传代培养。若细胞未达到汇合度，并且自上次传代已过去2-3天，则需更换培养基并继续观察。

实验步骤：

1. 吸取培养基：对悬浮细胞进行离心，去除培养基；对贴壁细胞则要轻微倾斜培养容器吸出培养基。
2. 加入新鲜培养基，确保细胞得到充分的营养。
3. 在培养容器中标注相关信息，并按要求孵育，继续监测细胞状态。
4. 若细胞达到传代的标准，按照适合的稀释比例转移细胞，加入新鲜培养基。

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